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前线腺癌患者在接收雄激素受体信号扼制剂（ARSI）调治后，可能会出现耐药性，导致调治带领的神经内分泌样前线腺癌（therapy-induced neuroendocrine-like prostate cancer,t-NEPC）发生。t-NEPC是一种高侵袭性亚型，具有小细胞样特征，对紫杉醇化疗具有耐药性，且总体糊口率较差。t-NEPC的相宜性神经特征是否是导致这种紫杉醇耐药性的原因尚不了了。
2024年8月25日，好意思国内布拉斯加大学M. Jordan Rowley & Samikshan Dutta团队融合试图揭示t-NEPC的神经相宜性特征是否与紫杉醇耐药性相干。议论团队通过分析患者基因抒发数据库，并通过ATAC-Seq、乙酰化组卵白ChIP-seq和RNA-seq等测序分析，探讨了Pax5算作转录因子在t-NEPC中的作用，以过甚在神经内分泌样特征基因抒发中的蹙迫性。相干议论服从以“Understanding the function of Pax5 in development of docetaxel-resistant neuroendocrine-like prostate cancers“为题发表在Nature出书集团旗下刊物《Cell Death & Disease》上。
标题：Understanding the function of Pax5 in development of docetaxel-resistant neuroendocrine-like prostate cancers（Pax5在多西紫杉醇耐药性神经内分泌样前线腺癌发展中的作用）
发表期刊：Cell Death & Disease
影响因子：8.1 / 1区
时期平台：ATAC-seq、ChIP-seq、RNA-seq等
本议论旨在相识Pax5在多西紫杉醇（多西他赛，docetaxel）耐药性神经内分泌样前线腺癌（t-NEPC）发展中的作用。当先，议论通过对患者基因抒发数据库的通路分析标明，t-NEPC上调与增强细胞网罗相干的多种神经通路。为轻易可能对促进t-NEPC中神经特征基因抒发蹙迫的转录因子（TF），议论在NE样细胞系模子中进行了ATAC-Seq、乙酰化组卵白ChIP-seq和RNA-seq测序，并分析了转录活跃且权臣富集的神经内分泌样（NE样）癌特异性基因的运行子。分析阻挡标明，Pax5可能是一个对神经基因抒发蹙迫的转录因子，且在t-NEPC中具有特异性。通路分析揭示Pax5抒发参与轴突导向、神经递质调控和神经粘附，这些对广博的细胞通信至关蹙迫。进一步阻挡标明，Pax5耗竭龙套了NE样细胞中神经突介导的细胞通信，并减少名义滋长因子受体激活，从而提升对多西紫杉醇调治的明锐性。t-NEPC特异性Pax5运行子CpG岛的羟甲基化有益于Pbx1谈判，从而带领Pax5抒发。基于此议论不错得出论断，捏续显现于ARSI疗法会导致t-NEPC中Pax5激活的表不雅遗传修饰，促进给与耐紫杉醇NE样癌症所需的基因抒发。因此，靶向Pax5轴可能有助于规复其紫杉醇明锐性。
议论智商：
利用公开的患者RNA-Seq数据进行分析。在NE样细胞系模子中进行ATAC-Seq、乙酰化组卵白ChIP-seq和RNA-seq。通过转录因子谈判位点分析、基因集富集分析（GSEA）和基因骨子（GO）分析等生物信息学智商进行数据默契。通过执行操作，如siRNA骚扰、过抒发质粒转染等，议论Pax5在细胞中的功能。阻挡图形
（1）NE样编削相宜特异性基因特征
图1：神经内分泌分化佩戴神经元特征。
A. C4-2BER细胞与C4-2B细胞之间的RNA抒发各异。
B. 对腺癌（C4-2B和C4-2，每组三个重复）和神经内分泌样（NE样）细胞（C4-2BER和DKD，每组三个重复）之间的基因抒发进行比较议论。I型基因集代表由REST扼制因子调控的基因，II型露出参与神经内分泌蹊径的转录调治因子。系数这些细胞系的RNA抒发分析在RNA-seq之后进行。
C. 在一样的腺癌和神经内分泌细胞系中对雄激素受体（AR）调控的基因进行比较分析。
D. 维恩图露出两种不同的神经内分泌样细胞系中共同各异抒发的基因。
E. 使用共有各异富集的基因集，使用gProfiler进行通路分析。BP代表生物学通路，MF代表分子通路。散点图露出与神经内分泌编削相干的各异化富集通路。
（2）染色质可及性和组卵白乙酰化增多，在NE样编削历程中带领转录激活
图2：神经内分泌分化中的染色质可及性各异。
A. 热图高慢C4-2B和C4-2BER中各异上调基因的ATAC-Seq信号比较。
B. 热图高慢C4-2B和C4-2BER中各异下调基因的ATAC-Seq信号比较。
C. IGV浏览器高慢C4-2B和C4-2BER中Hox A基因位点的各异ATAC seq信号。
D. 免疫思路高慢C4-2B和C4-2BER中H3K9、H3K18和H3K27组卵白乙酰化水平。
E. 热图高慢C4-2B和C4-2BER中各异活跃位点H3K27ac和H3K18ac的ChIP-Seq信号比较。
F. 维恩图高慢C4-2BER ATAC-seq峰值上发生的各异化ChIP-Seq（H3K18ac和H3K27ac）峰值重复。
G. 图2F的各异活跃染色质位点隔壁的基因的RNA-seq抒发水平（TPM）。
（3）神经内分泌转分化后Pax5抒发增多
图3：新可接近运行子隔壁的转录因子谈判各异。
A. 热图高慢A. C4-2B和C4-2BER细胞（N=3）中的转录因子抒发。
B. C4-2和DKD细胞（N=3）。
C-D. RT-PCR高慢C4-2与DKD以及C4-2B与C4-2BER细胞中Pax5、ETV5、FOXC1、ETS2、KLF12、ELF3的相对基因抒发。
E. 图像高慢与由TOMTOM细主义Pax5 motif比较，在各异活跃位点识别的motif。
图4：Pax5在不同细胞类型中的抒发。
A. 免疫思路图高慢C4-2、C4-2B、C4-2BER、DKD和NCI-H660中Pax5的比较抒发，HSC70为对照。（n=3）。
B. RT-PCR高慢C4-2B和C4-2BAR细胞中Pax5的RNA抒发。
C. 从小鼠细胞系中耗竭RB1后Pax5抒发。
D. 在LuCaP TMA中对Pax5进行染色。代表性的IHC染色高慢了Pax5在腺癌、CRPC和NE样癌症中的抒发。
E. 在编削性前线腺TMA中对Pax5进行染色。图中高慢IHC检测的Pax5抒发。
（4）Pax5 参与神经元通路相干基因抒发谱
图5：Pax5在NE样细胞中调控多种与神经相干通路。
A. 在Pax5耗竭后，C4-2BER和DKD中Pax5调控的蹙迫神经通路基因抒发烧图。
B. 使用在Pax5耗竭后NE样细胞中各异调控的Pax5基因进行GSEA通路分析。
C-D. 在NE样细胞C4-2BER和DKD中，通过siRNA倏得耗竭Pax5后，考据Pax5调控的基因集。
E-F. 在NE样细胞（DKD）中，通过多西环素带领的两个寂静shRNA倏得耗竭Pax5后，考据Pax5调控的基因集。
G. ChIP-qPCR高慢与阴性对照PGM5（两组引物P1和P2）和IgG比较，Pax5调控基因富集情况。
（5）Pax5耗竭增强了多西他赛在t-NEPC中的调治效果。
图6：Pax5耗竭影响细胞通信并增强调治效果。
A-E. 免疫荧光图像高慢在Pax5耗竭后，DKD和C4-2BER细胞名义NCAM1抒发情况，耗竭智商包括siRNA或shRNA（多西环素带领，shRNA抒发以红色荧光高慢）或在Pax5敲低细胞中异位抒发Pax5。
F. 超等图表代表在Pax5耗竭和Pax5过抒发下，C4-2BER和DKD中类神经突数目的定量分析。
G. 在DKD中，在对照和Pax5耗竭要求下，免疫思路高慢生物素拉下样本中NCAM1抒发。也高慢了对照和Pax5耗竭下的总卵白。
H-K. 在有或莫得Pax5情况下，通过丙碘铵染色在DKD和C4-2BER细胞平分歧定量化疗应激下的细胞活力。
L-M. 免疫荧光图像高慢在DKD和C4-2BER细胞中有或莫得Pax5情况下，磷脂酰肌醇激酶（p-AKT S-473）名义染色（DKD为品红色，C4-2BER为绿色）；条形图高慢定量。
N. 在DKD中，在对照和Pax5敲低要求下，免疫思路高慢p-AKT 473和总AKT的抒发。
O. 在DKD中，在对照和Pax5敲低要求下，免疫思路高慢p-EGFR与总EGFR的抒发。
（6）Pbx1调控NE样前线腺癌中Pax5抒发
图7：Pbx1调控Pax5。
A. C4-2B和C4-2BER细胞中Pax5运行子隔壁的ATAC-seq和H3K18/H3K27乙酰化ChIP-seq信号。
B. DKD与C4-2以及C4-2BER与C4-2B中Pbx1的抒发。
C. 腺癌和NE样细胞中Pbx1抒发的免疫思路。
D-E. 在DKD和C4-2BER细胞中Pbx1耗竭后Pax5抒发的RT-PCR分析。
F. C4-2BER细胞中Pbx1耗竭后Pax5抒发的免疫思路。
G. 使用计算在Pax5运行子上游的引物进行Pbx1 ChIP-qPCR。
H. DKD和C4-2细胞中Pax5基因的Epic甲基化芯片分析暗意图。绿色三角形代表位于CpG岛的区域。放大了两细胞系近端运行子的胞嘧啶甲基化景况，并高慢了每个区域的甲基化景况。红色代表甲基化/修饰的胞嘧啶，绿色是去甲基化胞嘧啶。Pbx1在运行子谈判位点由箭头露出。
I. 多样前线腺癌细胞系中TET2抒发的免疫思路。
J. Pbx1谈判位点的Pax5运行子区域通过ChIP-qPCR分析了5hmC踪迹标记。
K. DKD细胞用Bobcat339（50μM，18-24小时）科罚后进行5hmC和Pbx1 ChIP-qPCR，并与未科罚的对照样本比较。
L. 对DKD细胞用5-Azacytidine（0.1μM，5-7天）和Bobcat339科罚后，进行RT-PCR分析Pax5基因抒发。
M. 在t-NEPC保管中Pbx1/Pax5调控的举座暗意图。
易基因染色质可及性-转座酶易接近染色质测序（ATAC-seq）
ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing）是通过使用高通量测序对转座酶可接近性核染色质区域进行分析的一种立异表不雅遗传学议论时期。该时期通过转座酶对某种特定时空下洞开的核染色质区域进行切割，进而获取在该特定时空下基因组中系数活跃转录的调控序列。
真核生物的DNA并不是露馅的，而是被包装成核小体变成串珠状结构并进一步被折叠、包装。而基因的转录，需要将这种高等结构解开，使DNA成为不错使多样转录机器与其谈判的露馅景况，即变成洞开染色质区域。如何轻易洞开染色质区域呢？传统的智商主若是借助和DNase-Seq、MNase-Seq及ChIP-seq。但这些智商需要的肇始细胞量较大，对于小数样本和零散样本可行性不高。ATAC-Seq是一种新式的议论洞开染色质的时期，利用Tn5转座酶过问并切割露馅的DNA，并同期畅达上特异性的测序议论。因为切割和加议论一步完成，因此该时期可大大缩小所需细胞肇始量。
时期上风：
（1）所需细胞肇始量低。
（2）应用领域广，适用于大部分物种及细胞类型。
执行政策：
信息分析：
对于易基因染色质免疫共千里淀测序 (ChIP-seq)
染色质免疫共千里淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是议论体内卵白质与DNA互相作用的经典智商。将ChIP与高通量测序时期相谈判的ChIP-Seq时期，可在全基因组领域对特定卵白的DNA谈判位点进行高效而准确的筛选与轻易，为议论的真切开展打下基础。
DNA与卵白质的互相作用与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相干。期骗组卵白特定修饰的特异性抗体或DNA谈判卵白或转录因子特异性抗体富集与其谈判的DNA片断，并进行纯化和文库构建，然后进行高通量测序，通过将获取的数据与参考基因组精准比对，议论东说念主员可获取全基因组领域内某种修饰类型的特定组卵白或转录因子与基因组DNA序列之间的关系，也可对多个样品进行各异比较。
应用所在：
ChIP 用来在空间上和时分上不同卵白沿基因或基因组定位
转录因子和辅因子谈判作用复制因子和 DNA 建立卵白组卵白修饰和变异组卵白时期上风：
物种领域广：细胞、动物组织、植物组织、细菌微生物多物种富集教学；微量建库：只需5ng以上免疫千里淀后的DNA，即可伸开测序分析；决策无邪：凭据不同的样式需求，遴荐不同的组卵白修饰特异性抗体。时期道路：
易基因提供全面的表不雅基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表不雅转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C）、染色质结构与功能组学时期决策（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。
参考文件：
Bhattacharya S, Harris HL, Islam R, Bodas S, Polavaram N, Mishra J, Das D, Seshacharyulu P, Kalluchi A, Pal A, Kohli M, Lele SM, Muders M, Batra SK, Ghosh PM, Datta K, Rowley MJ, Dutta S. Understanding the function of Pax5 in development of docetaxel-resistant neuroendocrine-like prostate cancers. Cell Death Dis. 2024 Aug 25;15(8):617. pii: 10.1038/s41419-024-06916-y. doi: 10.1038/s41419-024-06916-y. PubMed PMID: 39183332.
细胞Pax5基因Pbx1seq发布于：广东省声明：该文不雅点仅代表作家本东说念主，搜狐号系信息发布平台，搜狐仅提供信息存储空间奇迹。